尽管存在这种操作差异，EyeLoop在消费级CPU（Intel i7 8700K，单核性能）上的处理速度仍超过1000 Hz，这远远超过了目前在CPU上使用DeepLabCut（～50 Hz，Intel Xeon E5-2603 v4，多核性能）和使用高端GPU（200–500 Hz，GTX 1080 Ti）时可实现的速度，即使在大幅降低采样率的情况下也是如此（Mathis和Warren，2018）。高处理速度对于几种类型的实验至关重要，包括需要非常快反馈的闭环实验，以及检查精细眼球运动的实验，如微扫视（>600 Hz）、扫视后振荡（>500 Hz）和注视（Juhola等人，1985；Nyström等人，2013）。此外，高频采样提供了高信噪比，使统计测试不那么费力（Andersson等人，2010）。这些发现共同证明，EyeLoop是DeepLabCut高速眼动追踪的一种有价值的替代品。然而，当速度无关紧要，或者视频素材质量较差（例如，包含频繁的搅拌、闪烁）时，DeepLabCut可能是实现更强大的眼动追踪性能的更好选择。

开环实验

为了证明EyeLoop在开环实验中的实用性，我们设计了一个提取器模块，该模块根据正弦波函数的相位调制监视器的亮度（图3和补充图1B）。使用这种设计，我们检测了清醒小鼠对光刺激的瞳孔反应性。

图3

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图3。开环实验揭示了小鼠瞳孔反应动力学。（A） 用于老鼠眼睛追踪的设置。热镜位于鼠标旁边和相机上方（A1–4）。显示视觉刺激的监视器被定位成面向鼠标（A3），而近红外光源被放置在背面（A2）。（B） 开环实验。正弦函数被映射到监视器的亮度上，在瞳孔区域产生振荡。（C） 来自频率为1、6和12个循环/分钟的三个开环实验的曲线图。（D） 使用瞳孔面积图的一阶导数计算的每个频率的收缩速度（vc）和膨胀速度（vd）。中心线为中值，框限为第25和第75个百分位数，胡须显示最小值和最大值*P<0.05，**P<0.01，无统计学意义，Wilcoxon符号秩检验。

更具体地说，瞳孔的大小由视网膜中一类特殊的固有光敏细胞调节，该细胞投射到中脑上部，并在瞳孔光反射中调节瞳孔大小（Lucas等人，2003；Markwell等人，2010年）。因此，当光线变暗时，瞳孔会扩张，让更多的光线通过虹膜到达视网膜。至关重要的是，瞳孔对光的反应性是临床医生评估患者神经状态的一个常见参数。例如，已经证明瞳孔光反应异常与颅内压升高相关，这可能反映了未诊断的疾病（Chen等人，2011）。因此，提供一种评估瞳孔反应性的方法是EyeLoop的一个有吸引力的临床使用案例。

为了检查瞳孔反应性，我们通过从1到12个周期/分钟的三个正弦波频率调节PC监视器的亮度；随着频率的增加，显示器的亮度在昏暗和明亮的设置中循环得更快。使用这种设置，我们的研究结果首先证实，瞳孔大小通过反比来监测亮度，这是瞳孔光反射的可预测结果（图3C）。其次，使用瞳孔面积的一阶导数，我们发现瞳孔收缩速度在小鼠的扩张速度中占主导地位，这反映了人类的发现（图3D；Ellis，1981）。总之，这些发现表明，EyeLoop非常适合检查活体受试者的瞳孔反应。

先天性眼球震颤模型与野生型小鼠的视动力反射

通常，神经系统疾病，如未确诊的脑出血或霍纳综合征，会导致眼睛明显异常。同样，患有先天性眼球震颤的患者由于视动力反射失败而表现出闪烁的眼球运动。检测这种神经病理学表现对于早期临床诊断和生物医学研究方案至关重要。为了展示EyeLoop是如何应用于这些末端的，我们证实了先前的研究结果，即Frmd7亚形态小鼠缺乏水平光动力反射；类似于Frmd7突变的先天性眼球震颤患者（Yonehara等人，2016）。更具体地说，我们比较了野生型和Frmd7敲除小鼠的光动力反射，其中Frmd7的外显子4从基因组中删除，从而旨在扩展关于亚形态基因型的表型报告（Yonehara等人，2016）。为了唤起光动力反射，我们使用双侧漂移的gr模拟了旋转运动讨论

用于眼睛跟踪的常规系统通常是为大眼睛量身定制的，例如在人类患者或非人类灵长类动物中。因此，这些系统在啮齿类动物身上的表现往往不太准确，因为它们的胡须和眼睑往往会遮挡瞳孔。EyeLoop通过生成高度详细的瞳孔标记来过滤遮挡。因此，EyeLoop为啮齿类动物的生物医学研究提供了一个有吸引力的系统，以研究疾病模型，如先天性眼球震颤（图4）。同样，我们最近在实验室中应用EyeLoop来监测视动反射，并研究视觉皮层中的光流计算（Rasmussen等人，2021）。

EyeLoop作为研究眼睛在大脑过程中的作用的工具，填补了一个重要的空白。感官整合是复杂的，眼睛通常在其编排中发挥着重要作用。感官探索过程中的眼动追踪提供了大量关于大脑如何使用感官的信息：例如，在快速全身旋转过程中，眼睛通过整合前庭和视觉信号，通过前庭-眼睛反射来稳定凝视（Fetter，2007）。然而，尽管已知感官计算的复杂性，视觉实验通常旨在严格监测眼睛（Meyer等人，2020）或在开环中应用单侧刺激（de Jeu和de Zeeuw，2012）。EyeLoop将眼睛集成为实验项目，为在线处理和分析提供瞳孔参数。EyeLoop非常高的速度可以实现快速的实验循环，这对研究视觉和神经动力学至关重要。事实上，精细的眼球运动，如后扫视振荡和微扫视，只能在高采样频率（优选大于1000 Hz）下辨别（Juhola等人，1985；Nyström等人，2013），目前除了EyeLoop之外，没有其他开源软件提供。同样，研究神经学习和可塑性的动力学需要非常精确的学习线索时间，例如，基于瞳孔大小和唤醒状态（McGinley等人，2015；Costa和Rudebeck，2016；王等人，2018；de Gee等人，2020）。EyeLoop通过其Extractor类无缝集成实验协议，使研究人员能够设计高速（>1000 Hz）迭代的环路，以揭示神经动力学的因果关系。因此，未来的实验可以通过光遗传学将EyeLoop应用于沉默或刺激特定的神经元群体，以研究神经元活动与神经系统运行的内源性参数之间的因果关系（Grosenick等人，2015）。

研究的局限性

EyeLoop的准确性取决于视频帧的质量，因此应优化照明和对比度以获得最佳效果。此外，EyeLoop易受帧间不一致的影响，例如长时间眨眼后。为了应对这个漏洞，EyeLoop在其主要算法失败的情况下会使用Hough变换。这使得EyeLoop能够在廉价的硬件上以非常高的速度运行，但与训练有素的基于深度学习的方法相比，这是以鲁棒性为代价的（Nath等人，2019）。沿着同一条静脉，EyeLoop的边缘检测很容易受到视觉障碍的影响，这些障碍无法通过阈值和高斯映射进行充分过滤，例如浓密的胡须和显著的眼睑重叠。然而，由于硬件密集型操作，深度学习方法通常仅限于离线处理。尽管存在这些限制，EyeLoop在速度、准确性和鲁棒性之间提供了一种有吸引力的平衡，从而通过高级编程实现了高速闭环实验。